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章节 F – 两种蛋白质的 MS/MS 搜索1 – 准备工作本次分析的背景是对 alpha-1-antitrypsin 和 proteinase 3 相互作用的分析。在 PR3 位置观察到一个凝胶带，但怀疑它可能是 a-1-a。除了仅通过 MALDI 分析外，我们希望获得尽可能好的序列覆盖率，因此在胰蛋白酶消化后，使用 Orbitrap XL 通过 ms/ms 进行分析。我 们希望使用 GPMAW 的 X!Tandem 搜索引擎，由于只涉及两种蛋白质，因此无需搜索大型数据库。数据通过使用 nanoLC 进行 30 分钟的短时间分离收集，并转换为峰列表。选择 mgf 文件格式，因为它比 dta 或 pkl 包含更多信息。数据保存在单独的目录中。
获取蛋白质：在主工具栏检索框中输入两种蛋白质各自的登录号（AAH96186 和 P01009），并从网络检索序列。 保存蛋白质：由于 X!Tandem 读取 FastA 格式文件，通过选择 File | Export sequence | all sequences as FastA file 将两个序列保存到文件中。文件保存为 PR3A1A.TXT，保存在与 ms/ms 数据相同的目录中，以保持项目组织有序。 设置搜索：通过 Search | MS/MS Search 调用 ms/ms 搜索对话框（另一种方法是按 F5 键或工具栏中的快捷方式）。 现在通过"Open"按钮选择创建的文件，或直接从文件资源管理器拖放。 选择的酶是胰蛋白酶，输出文件名保留默认值，选中"Search crap list"（污染物）。
由于搜索相当快（在我的机器上 3 秒），您可以调整参数以获得最佳结果。如果不更改"output file name"，结果文件将相互覆盖，不会用临时数据杂乱地占用磁盘。如果要保存结果，请在更改参数时更改输出文件名。加载新的搜索文件时，名称将自动更改。 选择 Met 的氧化和 Cys 的氨甲酰甲基修饰作为可变修饰和固定修饰。
选择"Enable refinement"，并选中"Semi cleavage"，因为我们可能会发现不寻常的切割（即凝胶带在 a-1-a 预期的 Mr 之下）。 2 – 结果
母离子的精度相当好，虽然校准并不完美（Alpha-1-antitrypsin 在 -4 到 0 ppm 之间，见右侧）。 Alpha-1-antitrypsin 是具有主要评分的第一个命中，因此很明显凝胶带含有这种蛋白质的主要比例。令人惊讶的是，牛血清白蛋白也在命中列表中，因此搜索现在转向发现污染物。 双击第一行 alpha-1-a，填写结果页面并显示序列，识别的肽段以红色显示。
从序列的注释页面来看，报告的信号序列为 1-24，与从残基 25 开始的第一个肽段完全吻合。然而，与完整蛋白质的胰蛋白酶消化运行相比，残基 150 之前缺少大量肽段。如果蛋白质从残基 150 或稍早处开始，蛋白质的所得质量将略高于 30 kDa，这与凝胶中观察到的相对分子质量相符。观察到第一个肽段的原因可能是由于存在三个组氨酸，使该肽段具有高质子亲和力，从而易于观察。 25-49 肽段的 ms/ms 光谱并不令人信服，强度低且主要峰未识别（右下方），
但是，35-49 肽段难以拒绝。
点击"Sequence"按钮  结论必须是我们很可能有一个在残基 150 或稍前处切割的 alpha-1-antitrypsin 截断形式，但它被少量全长蛋白质"污染"，需要进一步分析。 注意：当执行多个 ms/ms 搜索时，结果以 xml 文件保存在搜索目录中。这些可以通过"Open result file"按钮重新打开，或更简单地通过从文件资源管理器拖放打开。如果要直接与另一个搜索进行比较，可以打开第二个搜索窗口并将结果文件加载到其中。
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